O potrzebie wykonania badań DNA jest dziś bardzo głośno. Mówi się o tym w telewizji, pisze się w gazetach. Nawet w serialach kryminalistycznych możemy zobaczyć, jak kryminolodzy pobierają materiał genetyczny do analiz. A co się dzieje dalej? Na czym polegają takie analizy DNA? Badanie DNA najczęściej wykonywane jest za pomocą jakiejś odmiany reakcji PCR. Jest to obecnie najpopularniejsza metoda wykorzystywana w diagnostyce medycznej i kryminologii.
Metody z zakresu biologii molekularnej zaczęto wprowadzać do diagnostyki medycznej na początku XXI. Diagnostyka molekularna zyskuje coraz większe poparcie, bazuje bowiem na wielu różnych dziedzinach techniki i nauki, oraz pozwala na znacznie większą skuteczność i dokładność niż metody standardowe np. serologiczne. Metody oparte na analizie DNA znalazły szerokie zastosowanie w diagnozowaniu wielu chorób – w tym: genetycznych, nowotworowych, pasożytniczych i infekcyjnych. Nie wspominając już o tym, że za pomocą tych metod możemy zbadać pokrewieństwo, zidentyfikować sprawcę zbrodni, czy określić zgodność tkankową, dzięki czemu udało się uniknąć wielu odrzuceń przeszczepów. Najczęściej stosowaną metodą diagnostyki molekularnej jest obecnie technika PCR.
PCR, czyli reakcja łańcuchowej polimerazy (z ang. Polymeraze Chain Reaction) to metoda służąca do powielania interesujących nas fragmentów DNA. Technika ta została opracowana w roku 1983 przez amerykańskiego biochemika - Kary'ego Mullisa, która za to cenne odkrycie 10 lat później otrzymał nagrodę Nobla. Z pomocą techniki PCR możemy w krótkim czasie otrzymać miliardy kopii określonej sekwencji DNA. Następnie możemy określić jej długość i dokładną budowę.
Technika ta często służy nam do tego, aby sprawdzić czy dana sekwencja w ogóle występuje w badanej przez nas próbce. Przykładem może być diagnostyka boreliozy, podczas której sprawdzamy, czy DNA bakterii jaką jest Borrelia burgdorferi, dostało się do naszego organizmu po ukąszeniu przez kleszcza. W tym przypadku możemy zidentyfikować patogen przez pojawieniem się pierwszych symptomów choroby. W chorobach nowotworowych diagnozuje się tzw. markery genetyczne – czyli wszelkie zmiany, mutacje, które pojawiają się w danym genie. Zazwyczaj taka diagnostyka nie obejmuje jednej sekwencji, tylko analizuje się całe geny. Metoda PCR pozwala na diagnostykę zmian, których identyfikacja umożliwia określenie predyspozycji do określonych typów nowotworów.
Na czym polega technika PCR?
A na czym polega diagnostyka za pomocą techniki PCR? Najpierw musimy wyizolować DNA z naszych komórek. Gdy już mamy wyizolowane i oczyszczone DNA, to możemy przeprowadzić reakcję powielania interesującego nas fragmentu. W tym celu musimy posiadać specjalnie zaprojektowane, krótkie fragmenty DNA (tzw. startery), które są komplementarne do sekwencji okalającej fragment, który chcemy powielić. Następnie przygotowujemy mieszaninę reakcyjną, na którą składają się:
1. Matryca – czyli fragment DNA który chcemy powielić,
2. Wspomniane wyżej startery,
3. trójfosforany deoksynukleotydów (dNTP) – czyli niezbędne substraty, służące do syntezy powielanego DNA,
4. termostabilna polimeraza DNA – enzym katalizujący reakcję,
5. Odpowiedni bufor, który zapewnia odpowiednie pH reakcji.
Wszystko to umieszczane jest w tzw. termocyklerze – urządzeniu, które zdolne jest do szybkich, cyklicznych zmian temperatury. Próbka na początku ulega podgrzaniu do temperatury ok. 90 – 95ºC, co pozwala na rozplecenie (denaturację) helisy DNA matrycy. Następnie próbkę schładza się do temperatury, w której mogą się przyłączyć startery. Dla poszczególnych starterów jest ona nieco inna, zwykle wynosi 45-70ºC. W etapie trzecim temperatura znowu rośnie do optymalnej dla polimerazy DNA (około 72ºC). Startery się wydłużają i tworzy się nić DNA komplementarna do matrycy. Powyższy cykl powtarzany jest tak długo, aż uzyskamy odpowiednią ilość produktu (DNA). Następnie sprawdzamy, czy interesujący nas fragment występował w próbce i jaką ma długość. Zazwyczaj osiągamy to poprzez rozdział fragmentów DNA w żelu agarozowym.
Największymi zaletami tej metody jest niewątpliwie wysoka czułość, specyficzność i szybkość wykonania. W przeciwieństwie do innych metod, materiał genetyczny wykorzystywany w reakcji PCR może być w znacznym stopniu zdegradowany. Wystarczy śladowa ilość DNA – mniej niż 1μl. Technika PCR stosowana jest w kilku różnych odmianach. Najczęściej stosowaną obecnie odmianą PCR jest tzw. PCR w czasie rzeczywistym (Real- Time PCR).
Real- Time PCR – jak to działa?
Technika ta opiera się na klasycznej technice PCR wynalezionej przez Kary'ego Mullisa. Technika ta posiada dwie główne zalety: wysoką czułość reakcji, a także możliwość monitoringu ilości produktów reakcji po każdym jednym cyklu. Procedura jest prosta, szybka i pozwala zaoszczędzić czas na żmudnym analizowaniu ilości produktu po zakończeniu reakcji. Ponadto za pomocą RT-PCR możemy jednocześnie analizować kilka genów w kilkunastu różnych próbkach. W celu uwidocznienia DNA stosuje się różnego rodzaju sondy fluorescencyjne, które zawierają w swojej budowie fluorochrom (cząsteczkę zdolną do emisji światła o określonej długości fali). Stosując różne barwniki fluorescencyjne możemy analizować jednocześnie kilka sekwencji DNA w jednej próbce. Jaj widzimy, metoda ta ma bardzo wiele zalet. W gruncie rzeczy, jedyną wadą techniki RT-PCR jest cena sprzętu.
Oryginalny artykuł: http://www.genetico.pl/pcr-nowoczescna-i-niezawodna-technika-diagnostyczna.html